产品内容：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入1mL双蒸水充分溶解待用；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入1mL双蒸水充分溶解待用；
产品说明：
1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。
在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；（2）PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；（3）在340 nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
自备实验用品及仪器
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研钵、冰和蒸馏水。
 
操作步骤：
一、粗酶液制备：
1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。建议选取新鲜的植物样本。
二、测定步骤：
1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 工作液的配制：临用前在试剂二中加入全部试剂一，充分混匀，在 25℃孵育5min。
3、 按下表步骤加样：
试剂名称
测定管
空白管
样本（μL）
20
-
蒸馏水（μL）
-
20
试剂三（μL）
7
7
试剂四（μL）
7
7
工作液（μL）
180
180
 
记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2，计算ΔA测定=A1测定-A2测定，ΔA空白=A1空白-A2空白，ΔA =ΔA测定-ΔA空白。反应温度保持在25℃。空白管只做1-2管。
三、Rubisco活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1 nmolNADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T =344×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中每g组织1 min氧化1 nmolNADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力（U/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=344×ΔA÷W
3、按细菌或细胞数量计算
单位的定义：25℃中每1万个细菌或细胞1 min氧化1 nmolNADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总<, /font>×500) ÷T=0.69×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.14×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；W：样品质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
将上述公式中光径d-96孔板光径改为0.6cm进行计算。
  
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