Streptavidin Beads 6FF的重力柱说明书

货号：YA2500

规格：1*1mL / 1*5mL / 5*1mL / 3*1mL+1*5mL / 5*5mL

保存：2-8℃

产品说明：

    Streptavidin Beads 6FF利用生物素与链霉亲和素配体之间的相互作用纯化生物素或生物素化的蛋白、抗体等物质。链霉亲和素与生物素之间的亲和力很强，需要在变性条件下洗脱，链霉亲和素对亚氨基生物素的亲和力相对较弱，可以在pH9.5-11.0结合，pH4.0时洗脱，不需要使用变性剂所以能更好的保持亲和素偶联物的活性。Streptavidin Beads 6FF采用高度交联的6%琼脂糖介质，可耐受较高的流速及化学稳定性，适合大规模纯化。

表1：介质性能参数

纯化流程：

1、Buffer的准备 

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

1.1 生物素或生物素化物质的纯化 

平衡/洗杂液：20mM NaH₂PO₄，0.15M NaCl，pH7.4

 洗脱液：8M 盐酸胍，pH1.5

注意：这种苛刻的洗脱条件可能对样品和配体都有影响。而且由于配体的脱落，会导致树脂 的结合能力大大降低。所以在这些洗脱条件下，Streptavidin Beads 6FF不建议再次使用。可以选择用生物素竞争洗脱。

1.2 亚氨基生物素标签物质的纯化 

平衡/洗杂液：50mM碳酸铵，0.5M NaCl， pH10.0

洗脱液: 50mM 乙酸铵，0.5M NaCl，pH4.0

2、样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗杂液透析。

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3、样品纯化 

Streptavidin Beads 6FF重力柱使用请参考以下说明，各溶液用量均按照柱体积计算（柱体积是指填料体积）。

1) 水洗：将Streptavidin Beads 6FF重力柱固定在铁架台上，依次去掉上端塞和下端塞，使液体流出。当柱内剩余液面略高于上筛板，向管中加入5-10个柱体积的去离子水，去除残留的保护液。

2) 平衡：当液面略高于上筛板，向柱管中加入5个柱体积的平衡液，进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

3) 上样：将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min，保证目的蛋白与介质充分接触，提高目的蛋白的回收率。收集流出液，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况，在出现问题时，更方便寻找解决问题的方案。

4) 洗杂：用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

5) 洗脱：使用5-10倍柱体积的洗脱液进行目的蛋白的洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。

6) 水洗：依次使用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水平衡填料。将重力柱保存在等体积的20%乙醇中，置于2-8°C保存，防止填料被细菌污染。

4、SDS-PAGE检测

将纯化过程中收集的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

填料清洗 

Streptavidin Beads 6FF纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对树脂进行清洗。

1. 去除一些沉淀或变性物质 

用2倍柱体积的0.1M NaOH或6M盐酸胍或8M尿素溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。 

  2. 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1%TritonX-100 清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。