实时荧光定量PCR（qPCR）是现代分子生物学实验室的“扛把子”技术，应用极其广泛。然而，它也是一个细节决定成败的实验，那么，qPCR实验有哪些需要注意的地方呢？今天我们就来一起看下。

核酸提取质量控制

低质量的RNA模板会从多个方面干扰实验结果，可能造成假阳性或者假阴性，因此应在核酸提取完成后，立即进行质检：先用分光光度计测定浓度与纯度；随后用琼脂糖凝胶电泳评估完整性，理想结果应为清晰、无拖尾的单一条带。

1.分光光度计检测：
对于A260/280：如果1.9< A260/280< 2.1，说明RNA纯度较好；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白残留；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解，可经琼脂糖凝胶电泳进一步确认。
对于A260/230：如果2.0< A260/230< 2.2，说明RNA纯度较好；A260/230< 2.0，则说明RNA中可能有机试剂残留，如酚、乙醇或糖类等。

2.琼脂糖凝胶电泳：
以真核生物为例，若胶图上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三条单一的条带，说明提取的RNA完整度良好；如果出现拖带的现象，表示RNA部分降解；若胶孔内出现条带，说明可能有蛋白等大分子物质残留。

引物设计与准备

qPCR引物设计的好坏，直接关乎着扩增效率和产物特异性，是决定实验结果的关键因素。

引物的设计通常遵循以下原则：
1.目的片段长度控制在100 - 300 bp；
2.跨外显子设计，避免扩增gDNA；
3.上下游引物Tm值差异≤1℃；
4.GC含量40-60 %，极端GC会拉高或拉低Tm；
5.设计的引物需要进行扩增效率的检测，扩增效率达标（90-110%）才可用于定量实验；
6.引物浓度通常在0.1μM-1.0μM之间优化选择。

内参基因选择

qPCR内参基因要选择适合自己试验体系的、特异性稳定表达的内参基因，常见的有以下几种：

1.GAPDH/β-actin：传统常用，但代谢相关或增殖实验时可能不稳定，必须验证；

2.18S rRNA：表达丰度高，适用于总RNA量少的情况，但可能不适用于某些处理；

3.HPRT1/PPIA：在多种细胞和组织中表达相对稳定，是较好的初选对象；

4.YWHAZ/TBP：稳定性通常优于传统内参，尤其适用于发育、癌症等研究。

反应体系配置

反应体系优先推荐20μL和50μL。配置时要注意以下事项：

1.将试剂（酶、buffer、引物等）先混合再分装，减少加样误差和孔间差异；
2.每次实验都需要配制NTC（No Template Control，无样本对照）来验证体系中是否存在污染，配置体系时每一对引物都需要做NTC；
3.如果想检测RNA模板是否有gDNA残留，可将每个样本都配制NRT（No Reverse Transcriptase Control，无逆转录酶对照）进行检测；
4.模板为cDNA时，建议稀释5-10倍，减少反转录体系对qPCR实验的抑制作用，模板量预先进行梯度摸索，使CT值落在20-30之间最佳。

反应程序设定

不同的荧光定量酶反应条件不一样。常见的有配体法热启动酶和抗体法热启动酶，关于这两种酶反应条件的设定需要注意以下几点：

1.设置程序时要注意配体法的预变性为95℃，5min；抗体法的预变性为95℃，30min；
2.两步法可保证产物高特异，三步法可保证高效率扩增，可根据需求选择；

3.上机时尽量避免使用最外面一圈的孔。

以上就是对qPCR注意事项的总结，希望能够对大家的实验有所帮助。还有其他问题，欢迎评论区讨论哦。

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